Хроматографический анализ эфирных масел.
Хроматография – эффективный аналитический способ разделения компонентов эфирных масел и установления в них количественных отношений. Является наиболее информативным при исследовании и установлении качества эфирных масел.
Для проведения хроматографии с помощью микрошприца отбирают небольшой объем (0.04-0.06 мкл) эфирного масла и вводят при температуре 230-2500С в испаритель хроматографа. После испарения пары эфирного масла поступают в виде смеси с газом-носителем в узкую кварцевую капиллярную трубку длиной 30 метров и внутренним диаметром 0.25 мм. Под действием постоянно протекающего через эту трубку газа-носителя (обычно гелий, водород или азот) эфирное масло в виде пара движется по трубке. Одновременно, для улучшения фазовых и гидродинамических условий движения пробы температуру кварцевой трубки повышают от 500С до 2200С со скоростью 3-4 градуса/мин.
Внутренняя поверхность трубки (которая называется колонка) покрыта очень тонким слоем (0.2-0.5 микрон) нейтральной жидкости полимерной природы («жидкая фаза», имеющая свое коммерческое название, например, SE-30 или Carbowax 20M, отражающее хроматографические свойства фазы). Такая хроматография называется газо-жидкостной, так как разделение анализируемой пробы на компоненты происходит на границе текущего через колонку газа-носителя и жидким слоем фазы (жидкости, покрывающим внутреннюю поверхность трубки).
Компоненты эфирного масла имеют различное адсорбционное сродство к жидкой фазе, из-за чего скорость продвижения вдоль колонки веществ, составляющих эфирное масло, отличается друг от друга. В результате компоненты выходят из колонки последовательно в виде "сгустков" фракций отдельных веществ. Обычное время анализа эфирного масла не более 30-40 мин. В современных хроматографических методиках отдельное вещество может выходить из колонки в течение 3-7 секунд. Таким образом, за время анализа можно обнаружить до сотни веществ. Эти вещества различными методами детектируются.
Основным методом обнаружения веществ, выходящих из колонки является ионизационно-пламенное детектирование. С этой целью выходной конец колонки вставляется в детектор, представляющий собой тонкое сопло с непрерывно горящим пламенем водорода. Поступающие из колонки в пламя вещества ионизируются под действием высокой температуры и обнаруживаются высокочувствительным амперметром по появлению этих ионов. Количество ионов пропорционально количеству вещества в пламени.
В результате проведения хроматографического анализа получают хроматограмму, то есть графическое изображение состава эфирного масла в виде пиков. Каждый пик соответствует одному веществу с определенным временем выхода. Размеры пика указывают на количество вещества в пробе. Количественные соотношения (обычно в виде процентного отношения) рассчитываются автоматически с помощью компьютера. В современных хроматографах процесс разделения всех веществ пробы проходит с высокой степенью воспроизводимости как с точки зрения времени выхода, так и процентного соотношения отдельных компонентов.
На хроматограмме лавандина, полученной разделением на колонке HP-5 (малополярная метилсиликоновая фаза), пики с временем выхода 7.64 мин и 11.08 мин соответствуют главным компонентам - линалоолу и линалилацетату, содержание которых составляет 29% и 23%. Пик 8.44 мин – камфора, содержание которой 9%, 9.21 мин – борнеол (5%).
Хроматограмма эфирного масла лавандина.
Так как время выхода различных компонентов эфирных масел отличается друг от друга, естественным способом их идентификации является использование этого времени, как постоянной для каждого вещества. Использование этого метода имеет существенное ограничение, так как время выхода сильно зависит от условий хроматографирования (главным образом, давления газа-носителя и температуры колонки) и поэтому используется очень редко в строго постоянных условиях работы хроматографической системы, с эфирными маслами, состав которых известен. Полученные результаты верны обычно только в пределах одной лаборатории и даже прибора.
Более универсальным методом использования времени как хроматографической постоянной являются индексы удерживания Ковача (Kovach's retention index). Эти индексы рассчитываются по данным времени удерживания неизвестных веществ и веществ-стандартов, для которых индексы удерживания приняты постоянными. В качестве таких стандартов выбраны нормальные алканы. Например, индекс удерживания декана (алкана с 10 атомами углерода) принят как 1000, ундекана (11 атомов углерода) - 1100 и так далее. Если теперь взять неизвестное вещество и прохроматографировать в присутствии декана и ундекана, то в случае, если это неизвестное вещество выйдет по времени между этими стандартами, то его индекс удерживания будет располагаться между 1000 и 1100. Для более точных (но упрощенных) расчетов измеряют разность времен удерживания (ΔT=T2-T1) и разность индексов удерживания двух стандартных алканов (ΔRI=RI2-RI1), а также время удерживания неизвестного вещества (T) и вычисляют его индекс удерживания (RI) по формуле:
RI=RI1+ΔRI/ΔT*(T-T1)
Индекс удерживания является характеристикой определенного вещества в условиях хроматографирования на определенной жидкой фазе. Полученные индексы удерживания имеют универсальный характер и не зависят от динамических условий хроматографирования. Если говорить более точно, условия хроматографирования (температурные градиенты в процессе анализа, природа газа-носителя) слегка изменяют значение индексов удерживания. Но эти отклонения составляют не более 0.5 единиц для неполярных фаз и не более 5-8 - для полярных фаз.
Результаты хроматографического анализа представляют в виде таблицы веществ, составляющих эфирное масло с указанием индекса удерживания для каждого вещества и процентного содержания каждого компонента.
Конечно, когда разделяемые вещества имеют близкие индексы удерживания, условия хроматографирования могут привести к наложению пиков, что хорошо заметно при работе на высокоразрешающих капиллярных колонках. Тогда возникает необходимость коррекции условий анализа. Например, на неполярной фазе SE-30 (колонка HP-1) при применении газа-носителя азота происходит неполное разделение пиков пара-цимена, 1,8-цинеола и цис-β-оцимена. Использование водорода дает полное разделение этих веществ. При этом применение азота на неполярной фазе удобно для разделения триплета нерол, нераль и цитронеллол, тогда как применение водорода приводит к почти полному наложению этих пиков. Впрочем, всех этих затруднений можно избежать при анализе эфирных масел на колонке типа HP-5.
Различные режимы программирования температуры в ходе анализа также влияет на индексы удерживания. Некоторые вещества имеют "плавающие" индексы удерживания. Это происходит в случае, если проба содержит большое количество растворителя. В зависимости от величины пробы растворитель в большей или меньше степени как бы "притягивает" некоторые вещества, изменяя их индекс удерживания. Например, этилацетат в присутствии большого количества этилового спирта уменьшает свой индекс удерживания (до 10 единиц) и может совмещаться с бутанол-2 (при анализе компонентов коньячного спирта).
Применение хроматографии для распознавания фальсифицированных эфирных масел.
Для решения вопроса о натуральности эфирного масла проводят его хроматографический анализ и сравнивают полученную хроматограмму с хроматограммой заведомо натурального образца эфирного масла, опубликованных в специальных изданиях (метод «fingerprint analysis») или полученной анализом заведомо аутентичного образца эфирного масла. Отдельные компоненты эфирных масел обладают оптической активностью, то есть способностью вращать плоскость поляризации луча света. Синтетические вещества, которые иногда добавляют в эфирные масла, не имеют такой активности. Хроматографические методы на специальных хиральных колонках позволяют разделить оптические изомеры и установить факт фальсификации.
Разработка конкретных методических подходов, которые можно использовать при исследовании эфирных масел на натуральность представляет большую трудность. Каждое эфирное масло можно фальсифицировать различными методами. В любом случае на первом этапе необходимо получить хроматограммы эфирного масла на капиллярных колонках. При этом наиболее рационально использовать колонки с длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25мм и слоем жидкой фазы 0.25 микрон.
Наиболее часто используют неполярную колонку с рабочей жидкой фазой на основе полиметилсилоксана (силиконовые эластомеры SE-30 или аналогичные OV-1, OV-101, DB-1, DB-5, HP-1, HP-5). Именно на этих колонках получено для эфирных масел наибольшее количество результатов (хроматограмм и индексов удерживания компонентов). Очень хорошие результаты для экспертной работы дает колонка типа HP-5 (или DB-5).
Значительно реже применяют высокополярные колонки на основе полиэтиленгликоля с молекулярной массой 20000 (Carbowax 20M, Supelcowax10, FFAP, INNOWAX). Их используют лишь как вспомогательные в случае неоднозначной идентификации пиков на колонках с неполярной фазой. Дело в том, что при использовании хромато-масс-спектрометрии не всегда удается отличить достоверно спирты и их сложные эфиры, а также сесквитерпеновые углеводороды и некоторые их кислородные производные. Применение различных колонок дает возможность по изменению индексов удерживания одних и тех же веществ при анализе определиться с точной идентификацией.
Режим анализа на обоих колонках одинаковый. Температура испарителя и детектора 230-2500, температура термостата программируют от 500С со скоростью 30/мин до 2200 и далее изотерма 10 минут. Газ-носитель водород или гелий – все газы с чистотой 99.999. Полярные колонки дают нестабильные результаты при работе с газами с повышенным (более 0.001%) содержанием кислорода и паров воды. Скорость расхода газа через колонку приблизительно 1 мл/мин, что соответствует входному давлению для гелия 0.75 атм. Величина пробы 0.02 - 0.06 мкл при сбросе 1/50. Такой режим позволяет выявить в составе эфирного масла все компоненты с содержанием выше 0.01%, что вполне достаточно для экспертной работы.
Относительно приборной базы можно сказать, что для работы вполне достаточны обычные хроматографы практически любой конструкции (как старые, так и новые) с пламенно-ионизационным детектором. Наиболее важным при этом является правильно сконструированная система ввода пробы – самплер (иногда ее надо переделывать в хроматографах старой конструкции) и грамотное подсоединение колонки к детектору и самплеру. Но это уже вопрос очень специальный и здесь не рассматривается.
Полученные хроматограммы дают исчерпывающую информацию о составе эфирных масел и представляют собой подробную «карту» распределения всех компонентов эфирного масла, изучение которых методом сравнения с типовыми или эталонными хроматограммами может помочь в установлении подлинности и натуральности эфирного масла. При этом особое значение для установления натуральности часто имеют компоненты, содержащиеся в очень небольшом количестве, а также сесквитерпеновые терпеноиды, состав и количество которых хорошо отражает видовую принадлежность эфирного масла.
Ниже сопоставлены две хроматограммы, полученные в результате анализа натурального (вверху) и фальсифицированного эфирного масла дистиллированного лимона.
В натуральном масле число компонентов значительно больше, содержание лимонена (пик 10.11) составляет 63%. Присутствуют сложные эфиры – нерилацетат и геранилацетат (пики 24.36 и 25.17). В области сесквитерпеновых углеводородов в натуральном эфирном масле присутствуют характерные для лимона компоненты: β-кариофиллен (пик 26.50), транс-α-бергамотен (пик 27.23) и β-бисаболен (пик 30.20).
Фальсифицированное масло содержит 93% лимонена (пик 10.13). Это значительно выше показателя, характерного для натурального лимонного масла (58-72%). Обычно для создания такого лимонного масла используют детерпенизированное лимонное масло с небольшой добавкой синтетического или природного цитраля (пики 18.98 и 20.30). Практически отсутствуют сесквитерпены и сложные эфиры – нерилацетат и геранилацетат, характерные для натурального масла. Добавлены нехарактерные для натурального лимонного масла линалоол и линалилацетат (пики 12.86 и 19.68).
Хроматограмма натурального (вверху) и фальсифицированного (внизу) эфирного масла лимона.
При установлении подлинности эфирного масла необходим здравый смысл и интуиция, а также длительный опыт работы в области хроматографирования эфирных масел различных типов, сортов и происхождения. Это позволяет различать эфирные масла при рассмотрении хроматограммы так же легко, как мы узнаем знакомого человека по его внешнему виду.
Основная проблема хроматографии – идентификация отдельных пиков, то есть расшифровка состава эфирного масла на основании данных, полученных в результате хроматографирования. Обычная хроматография с пламенным детектором имеет ограниченные возможности идентификации и ее используют для анализа эфирных масел, для которых качественный состав и последовательность выхода компонентов известна. Для экспертной работы, которая связана с выявлением неизвестных примесей в эфирных маслах, необходимо применять масс-спектрометрический детектор. Это делает возможным проводить идентификацию компонентов эфирного масла автоматически, в ходе выполнения аналитического цикла. Такие хроматографы, сочетающие обычный хроматограф (GC) и масс-спектрометрический детектор (MSD) получили название хромато-масс-спектрометра (ХМС, GCMS – gas-chromatography-mass-spectrometry). Обычная стоимость хроматографа с пламенным детектором - 10,000-50,000$ (чаще всего цена зависит от производителя), стоимость хромато-масс-спектрометра 110,000-200,000$.
При идентификации компонентов методом MS выходящие из колонки вещества не попадают в горящее пламя водорода, а направляются в вакуумную камеру, где попадает в поток электронов, имеющих стандартную энергию (70 эв). Эти электроны разбивают молекулу вещества на заряженные осколки (ионы), состав, заряд и количество которых в стандартных условиях для каждого вещества является постоянным. Графическое изображение каждого вещества после электронного удара в виде набора его фрагментов в координатах «молекулярная масса иона - количество ионов» называется масс-спектром. Информация о веществах, их структуре и соответствующих им масс-спектрах хранится в виде баз данных в компьютерах, обслуживающих работу GCMS. В процессе хроматографического разделения по мере выхода веществ из колонки происходит непрерывная их бомбардировка электронами, получение масс-спектра, сравнение его с базой данных и выдача результатов. Наибольшая по объему библиотека масс-спектров находится в базе данных NIST05 (175000 структур) и Wiley (около 300000 веществ).
Масс-хроматограмма эфирного масла, декларированного как нероли.
1 6.927 0.399% α-пинен
2 8.259 0.239% сабинен
3 8.361 1.275% β-пинен
4 8.901 0.537% мирцен
5 10.184 0.249% пара-цимен
6 10.356 7.669% лимонен
7 11.149 0.304% оцимен
8 11.564 0.850% γ-терпинен
9 13.591 30.701% линалоол
11 15.392 0.620% цис-β-терпинеол
12 16.250 0.233% транс-β-терпинеол
13 17.476 4.988% α-терпинеол
14 17.742 1.464% γ-терпинеол
16 20.361 26.146% линалилацетат
19 22.025 0.223% индол
20 23.959 0.892% метилантранилат
21 25.782 0.657% геранилацетат
22 31.897 3.279% цис-неролидол
23 33.083 4.840% транс-неролидол
24 40.388 2.886% бензилбензоат
25 43.968 9.213% бензилсалицилат
Результаты GCMS представляют собой ряд предложений по идентификации в виде альтернативных формул веществ и степень сходства их масс-спектра с масс-спектром, полученным в ходе хроматографического разделения. Задача исследователя – отобрать из них наиболее приемлемый вариант. На рисунке показан масс-спектр неизвестного вещества с временем выхода 33.08 мин. Ниже показан рисунок масс-спектра вещества, наиболее близкого по масс-спектру с неизвестным веществом. Степень сходства составляет 92%. Таким образом, для неизвестного вещества с временем выхода 33.08 мин принят транс-3,7,11-триметил-1,6,10-додекатриен-3-ол, который имеет тривиальное название транс-неролидол.
Масс-спектр одного из компонентов с временем выхода 33.08 мин на хроматограмме эфирного масла нероли.
Масс-спектр и формула вещества, предложенного для компонента с временем выхода 33.08 мин.
При установлении химического состава методом хромато-масс-спектрометрии пользуются законами биогенетической взаимосвязи компонентов в эфирных маслах. Например, если в эфирном масле идентифицирован линалилацетат и не найден линалоол, то это не является правильным выбором. Аналогично, если идентифицирован нерол, а отсутствует гераниол (эти два вещества всегда присутствуют вместе), то такая идентификация сомнительна. Часто тимол сопровождает карвакрол, пара-цимен и γ-терпинен, пинокамфон – изопинокамфон, ментон - изоментон. Взаимосвязи компонентов в эфирных маслах обусловлены существующими в растениях достаточно однообразными биохимическими процессами, которые связывают все компоненты эфирных масел в единый биологический цикл. Знание таких процессов позволяет избежать ошибок при идентификации.
После идентификации всех компонентов данные анализируют и сопоставляют с данными, полученными для образца натурального нероли. При этом сразу можно обратить внимание, что в составе исследованного эфирного масла нероли находятся компоненты, которые в натуральных эфирных маслах встречаются очень редко и в небольшом количестве – это β-терпинеол (цис- и транс-изомеры) и γ-терпинеол. Эти терпинеолы обычно сопутствуют синтетическому α-терпинеолу. Они также содержатся в эфирных маслах, которые подвергли редистилляции. Кроме того, неролидол в нашем образце содержится в виде двух изомеров (цис- и транс-неролидола) в то время как в природных продуктах содержится только транс-изомер. Среди посторонних для нероли примесей можно обнаружить также бензилбензоат и бензилсалицилат, но при этом отсутствует типичный для нероли фарнезол. При наличии геранилацетата отсутствует нерилацетат (они всегда в природных продуктах сопутствуют друг другу). Уже эти данные указывают на искусственное происхождение проанализированного образца эфирного масла. Известно, что в лучшем случае для приготовления искусственного нероли используют эфирное масло петигрейн-парагвай. В данном случае мы имеем типичный случай подобной фальсификации. Такую искусственную смесь синтетических добавок (терпинеолы, бензилбензоат, бензилсалицилат, индол, метилантранилат, линалилацетат) и натурального петигрейн-парагвай очень часто предлагают как хороший заменитель натурального нероли.
Хроматограмма натурального стандартного эфирного масла нероли (Тунис)
1. a-пинен 1%
2. сабинен 1%
3. b-пинен 6-10%
4. мирцен 2%
5. a-терпинен 0.1%
6. лимонен 10-15%
7. Цис-b-оцимен 1%
8. транс-b-оцимен 7%
9. γ-терпинен 0.2%
10. терпинолен 0.4%
11. линалоол 30-45%
12. терпинен-4-ол 0.5%
13 a-терпинеол 2-4%
14. нерол 1-2%
15. гераниол 2-3%
16. линалилацетат 2-12%
17. метилантранилат 0.1-0.3%
18. нерилацетат 2%
19. геранилацетат 4%
20. b-кариофиллен 0.5%
21. b-фарнезен 0.2%
22. гермакрен D 0.2%
23. бициклогермакрен 0.3%
24. неролидол 1-2%
25. фарнезол 1-2%
Частая ошибка идентификации - ложные пики, образующие как артефакты при анализе эфирных масел (остатки от предыдущей пробы, примеси в растворителях, продукты разложения жидкой фазы в колонках). Такие "находки" следует ждать всегда. По крайней мере, надо хорошо представлять возможный химический состав хроматографируемого объекта и упредить появление возможных "фантомов".
Кроме того, каждый компонент, идентифицированный с помощью хромато-масс-спектрометра, должен быть сверен со своим индексом удерживания и лишь на основании такой всесторонней оценки делается вывод об окончательной идентификации.
Иногда для получения вспомогательной информации (для уточнения идентификации) проводят хромато-ольфактометрию профиля компонентов эфирных масел. Для этого в процессе хроматографического анализа выходной конец хроматографической колонки обнюхивают. Выходящие последовательно компоненты эфирного масла оцениваются экспертами качественно. Наиболее интересные вещества идентифицируются для возможности дальнейшего их синтеза и использования для создания парфюмерных композиций. Этим методом, удается четко и наглядно представить себе вклад отдельных составляющих эфирного масла в его аромат. Так было установлено, что в состав эфирного масла розы входят на уровне миллионных долей органические сульфиды, гнилостный запах которых иногда удается почувствовать в некоторых образцах эфирного масла розы. Не следует думать, что "плохой" запах - это плохо. Среди компонентов эфирных масел многих цветочных растений (жасмин, например) содержатся производные индола, имеющие в чистом виде запах человеческих экскрементов. Но при содержании на уровне 0.01% они имеют запах очень похожий на запах жасмина.
